细胞外囊泡（EVs）是由肿瘤细胞等多种细胞分泌的、大小为50～1000nm的膜性囊泡小体，存在于血液、尿液、脑脊液等大多数体液中，EVs可以携带多种胞内物质，如不同来源EVs可包含多种蛋白质、mRNA和microRNA分子，在细胞间信号传递、肿瘤的发生与预后监测、免疫系统干预等生理病理活动中扮演重要角色。EVs内的miRNA由于受囊泡脂质双层膜的保护因而具有更高的酶耐受性，可以在体液中长时间稳定存在。近年来，直径为30~200 nm的外泌体样小细胞外囊泡（sEVs）内的各种microRNA受到了广泛关注。与血液中循环miRNA相比，sEVs内miRNA水平变化更能反映机体内生理病理状态，sEVs内多种miRNA表达谱水平变化也被发现与多种癌症密切相关，因此可以作为一种新型的液体活检生物标志物。
sEVs的纳米级结构和miRNA极短的核苷酸序列长度（～22nt）使得sEVs内miRNA检测困难。常规检测组织细胞中miRNA的方法以RT-qPCR为金标准，其灵敏度高，但其cDNA合成、qPCR等步骤复杂，且无法实现sEVs的在体原位检测。
2020年9月2日，重庆大学医学院智慧检验与分子医学中心罗阳教授团队、重庆大学生物工程学院王贵学教授团队联合北京大学人民医院贾玫教授团队在材料领域知名期刊《Small》（影响因子11.459）发表封面论文“High-Fidelity Determination and Tracing of Small Extracellular Vesicle Cargoes.”（全文地址：http://doi.org/10.1002/smll.202002800）。该研究开发了一种原位sEVs内miRNA原位检测新方法，通过设计不破坏sEVs结构、有效进入sEVs胞内而不被酶降解的DNA四面体探针，实现miRNA高特异原位捕捉和定量检测。原理如图1。
图1. sEVs内miRNA原位检测原理图
研究者们设计的fLuorescent Intracellular-Guided Hairpin-Tetrahedron (fLIGHT)四面体纳米探针，尺寸为5.4~8.0 nm，结合发卡探针实现靶标miRNA的互补，分子信标的茎环结构和各荧光基团间的发光效应，直接实现sEVs内miRNA分子表达丰度的检测，其检测限为45.4 fM，见图2。
图2. fLIGHT探针检测miRNA原理及不同浓度检测
fLIGHT能够保持几何形状稳定的同时具有良好的穿透力，为验证fLIGHT探针无损进入sEVs，构建蛋白芯片验证其能够保持sEVs膜完整的同时进入sEVs实现胞内miRNA的检测，见图3。
图3. sEVs表征及fLIGHT无膜破损进入sEVs内检测miRNA
同时，本研究显著区分了临床肺癌患者和正常人血浆中sEVs内miRNA丰度，对比传统方法RT-qPCR具有良好的一致性，见图4。
图4. fLIGHT检测临床非小细胞肺癌患者血浆sEVs内miR-21
总之，本研究设计建立了一种sEVs内miRNA分子在体可视化检测技术平台，通过改变分子信标探针设计即可以实现对各种靶分子的检测，这对于在体研究sEVs与细胞相互作用规律、阐明sEVs内生物分子调控肿瘤的发生、发展过程的机制具有重要意义。
本研究由重庆大学医学院、重庆大学生物工程学院、北京大学人民医院等多家单位联合攻关完成。重庆大学陈晓辉博士、北京大学贾玫教授、北京大学刘炼华博士为本研究并列第一作者，重庆大学医学院智慧检验与分子医学中心罗阳教授和重庆大学生物工程学院王贵学教授为本研究共同通讯作者。本研究受到国家自然科学基金（81871733, 81772061）、中央高校基本科研业务经费（2019CDYGZD005, 2020CDJYGRH-YJ05, 2019CDYGZD007, 2019CDXYSG0004）、重庆市自然科学基金（CSTC2016SHMSZTZX10005），轻工业五粮液风味白酒固态发酵重点实验室开放基金（2019JJ003）等项目的支持。
参考文献：
Xiaohui Chen, Mei Jia, Lianhua Liu, Xiaopei Qiu, Hong Zhang, Xingle Yu, Wei Gu, Guangchao Qing, Qingmei Li, Xiaolin Hu, Ruixuan Wang, Xianxian Zhao, Liangliang Zhang, Xianfeng Wang, Colm Durkan, Nan Wang, Guixue Wang*, Yang Luo*. High-Fidelity Determination and Tracing of Small Extracellular Vesicle Cargoes. Small. 2020.
