胞外囊泡是由细胞直接分泌的在细胞间起通讯作用的脂质双层结构，因在免疫反应和癌症等生理和病理过程中发挥重要作用，因而成为近来研究热点。由于血浆中 RNA降解酶的存在，胞外囊泡内miRNAs的丰度和稳定性均优于血浆来源的循环miRNAs，使其更具研究价值。目前常规的miRNA检测方法要实现对胞外内多靶标 miRNAs的直接检测仍然十分具有挑战性。近日，重庆大学医学院罗阳教授团队通过将滚换扩增技术和CRISPR/Cas9系统相结合，研发了一种多靶标等温核酸检测系统，可用于胞外囊泡内多种miRNA的直接分析。
疾病的快速无创检测一直是科学研究的热点。miRNAs因其在各种病理过程中的重要调节作用，长期以来被认为是非常有价值的诊断和预后生物标志物。建立快速实现miRNAs表达差异分析的方法，可以帮助实现疾病的早期诊断和更准确地监测治疗效果。miRNAs的长度约为19-23 nt，常规PCR检测由于引物设计十分困难而应用受限。尽管RT-qPCR克服了检测的限制，但它需要包括miRNAs提取、逆转录和qPCR等多个耗时的连续步骤。其他检测方法例如Northern Blotting和Microarray则存在着检测灵敏度低、成本高、技术复杂等缺点。此外，现有的检测方法在用于多个同源性靶标miRNAs的检测时，仍然存在特异性差的问题。
图一：RACE检测原理
重庆大学医学院团队研发的等温多靶标核酸检测系统（RACE），很好的弥补了上述缺憾。众所周知，滚环扩增（RCA）是一种高度特异的恒温核酸扩增方法，在具有热稳定性的DNA聚合酶的辅助下无需热循环仪器，恒温条件即可进行核酸扩增。RCA反应的高特异性主要归因于靶标和环状DNA模板之间需完全互补才得以启动扩增步骤，这使得它特别适用于单核苷酸多态性（SNP）的分析。在CRISPR/Cas9这一经典的基因编辑系统中，Cas9蛋白在单链引导RNA( sgRNA) 存在的情况下，通过识别含有PAM结构的双链DNA而进行精准剪切，可用于高效、快速地核酸精确检测。本项目中，RACE核酸检测系统综合了RCA和CRISPR/Cas9技术的优点，构建出一个多功能的等温多靶标核酸检测平台，可用于胞外囊泡内多种miRNAs的等温定量分析，这对于疾病诊断和预后评估具有重要意义。方法学评价结果表明，RACE与miRNA检测金标准方法RT-qPCR
具有良好的一致性，证明了RACE的应用可靠性。
图二：RACE用于多重miRNA检测的原理和结果
RACE核酸检测系统可以用于一系列miRNAs的等温多靶标多重检测，同时已被证明是一种可在复杂样品环境中具有高度特异性的多靶标等温核酸检测技术，可达到fM级灵敏度和单碱基特异性。这种多功能、稳定的方法经过进一步改进后可以研制出便携检测设备，在临床诊断和紧急医疗辅助方面具有很大的潜力。
图三：RACE检测不同样本的相关性分析
这一成果近期发表在Analytical Chemistry上，西南大学硕士研究生王睿璇和陆军军医大学硕士研究生赵贤贤为该文章并列第一作者。该项目受到国家自然科学基金（81871733, 81572079）、中央高校基金（2019CDYGZD005,
2019CDYGZD007, 201810611238）、重庆市教委研究生导师团队等项目的支持。
论文信息：
Ruixuan Wang，Xianxian Zhao，Xiaohui Chen，Xiaopei Qiu，Guangchao Qing，Hong Zhang，Liangliang Zhang，Xiaolin Hu，Zhuoqi He，Daidi Zhong，Ying Wang，Yang Luo*. RCA-Assisted CRISPR/Cas9 Cleavage (RACE) for Highly Specific Detection of Multiple Extracellular Vesicle MicroRNAs. Aanl.Chem., 2020, 92, 2, 2176-2185. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04814
